Evaluación de la biopelícula.

Jun 04, 2024

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 18669 (2022) Citar este artículo

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La formación de biopelículas es una de las principales causas de complicaciones después de la cirugía en entornos clínicos. En este estudio, perfilamos la capacidad de formación de biopelículas de varios patógenos asociados a infecciones periprotésicas en superficies médicamente relevantes, poliestireno (PS) y titanio (Ti). También exploramos cómo un factor estresante ambiental específico, el galato de epigalocatequina (EGCG), afectó la formación de biopelículas. Primero, las pruebas de rojo Congo revelaron que todos los microorganismos formaban biopelículas en 72 h. Luego, se determinaron las cantidades de formación de biopelículas en PS a las 24, 48 y 72 h y también en una placa de Ti durante 72 h. Algunos microbios prefirieron una superficie sobre la otra, mientras que otros microbios formaron niveles constantes de biopelícula independientemente del material de la superficie. Staphylococcus lugdunenensis fue el más potente, mientras que Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus fueron los más débiles. Las pruebas de adhesión bacteriana a hidrocarburos (BATH) indicaron que la capacidad de formar biopelículas no estaba directamente correlacionada con la hidrofobicidad de la superficie celular (CSH). Finalmente, se aplicó una señal externa, EGCG, para desafiar la formación de biopelículas de cada microorganismo. EGCG reguló la capacidad de cada microorganismo de manera diferente, aunque el cambio fue consistente en todas las superficies para la mayoría de los patógenos. Este estudio puede ayudar a comprender mejor un amplio espectro de patógenos asociados a infecciones periprotésicas mediante la comparación relativa de sus capacidades de formación de biopelículas.

Las biopelículas son comunidades bacterianas organizadas incrustadas en una matriz extracelular compuesta de sustancias poliméricas extracelulares de producción propia, como polisacáridos, proteínas, lípidos y ADN1. Diversos estímulos inducen a las bacterias a formar biopelículas en una superficie2 y se comportan de manera diferente al modo de crecimiento planctónico3. Infecciones bacterianas peligrosas, como las infecciones del sitio quirúrgico, se atribuyen a estas bacterias, que están protegidas de los antibióticos comunes4,5. Las bacterias forman especialmente biopelículas en dispositivos médicos como implantes, causando infecciones del tracto urinario asociadas al catéter, mucositis periimplantaria y periimplantitis6,7,8. Una mejor comprensión de la formación de biopelículas puede inspirar estrategias para prevenir estas enfermedades infecciosas.

Las biopelículas pueden estar formadas no sólo por bacterias que invaden desde el exterior sino también por bacterias comensales que se vuelven patógenas9. Las bacterias comensales protegen al huésped en condiciones fisiológicas normales de la colonización e invasión de patógenos al producir antimicrobianos y competir por nutrientes o sitios de adhesión10; esto cambia en condiciones patológicas o inmunológicamente comprometidas, donde pueden promover enfermedades inflamatorias que dañan al huésped11. Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa son las dos especies de bacterias representativas identificadas como las principales causas de enfermedades infecciosas graves12. Staphylococcus aureus suele actuar como comensal de la microbiota humana, que se encuentra en la flora normal de la piel, las mucosas y el tracto reproductivo13,14,15. Sin embargo, esta bacteria puede causar diversas enfermedades, desde infecciones leves hasta enfermedades potencialmente mortales. Las cepas resistentes a los antibióticos, como S. aureus resistente a la meticilina, son particularmente problemáticas en las clínicas16. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista entre individuos inmunocomprometidos17; aunque no es tan virulento como S. aureus, P. aeruginosa es el colonizador más frecuente de dispositivos médicos como catéteres 18. Los estafilococos coagulasa negativos como Staphylococcus lugdunensis también causan muchas infecciones articulares periprotésicas19. Otras bacterias patógenas notables asociadas con implantes médicos incluyen especies de Streptococcus y Enterococcus20.

Varios mecanismos biológicos regulan la formación de biopelículas. Un ejemplo representativo es la detección de quórum, que es la capacidad de regular la expresión genética en respuesta a la densidad de población celular21. Las características estructurales de los microorganismos también determinan la formación de biopelículas22. De hecho, la biopelícula es el resultado integrado de una comunidad bacteriana que incluye factores internos y externos. Sin embargo, cada microbio que contiene puede tener una capacidad única para formar una biopelícula respondiendo de manera diferente a la misma señal ambiental. Sin embargo, la mayoría de los estudios sobre biopelículas se han centrado en una especie específica o en unas pocas23,24,25. Creíamos que se necesita un enfoque colectivo para comprender de manera integral los comportamientos relacionados con las biopelículas de una comunidad bacteriana. A través de este estudio, probamos un amplio espectro de patógenos médicamente relevantes para determinar su capacidad de formar biopelículas e intentamos confirmar qué microorganismos eran resistentes en la formación de biopelículas en condiciones similares a las situaciones clínicas reales.

En este estudio, estudiamos la capacidad de los patógenos para formar biopelículas en tubos de cultivo de poliestireno (PS) y placas de titanio (Ti), cuyas superficies suelen proporcionarse en los campos médicos. PS es una resina plástica utilizada para aplicaciones de dispositivos médicos, incluidos envases transparentes, componentes de diagnóstico, placas de cultivo celular y carcasas para kits de prueba26. El Ti se utiliza ampliamente como material para implantes biomédicos y dispositivos quirúrgicos27. Cada patógeno mostró la capacidad única de formar biopelículas en PS y Ti, y respondió de manera diferente al desafío con un estímulo externo utilizando galato de epigalocatequina (EGCG). Entre los microbios probados, S. lugdunensis tenía la capacidad más potente para formar biopelículas en ambas superficies. Comprender las capacidades de estos patógenos médicamente relevantes para formar biopelículas en un entorno clínico es un requisito previo para superar infecciones peligrosas en entornos clínicos.

Primero evaluamos si los microbios para este estudio podrían formar biopelículas porque sus capacidades se desconocían previamente (Tabla complementaria 1). Se realizó la prueba del rojo Congo para distinguir a los productores de biopelículas de los no productores (Fig. 1). En cultivo en caldo, el color del medio de S. agalactiae, S. aureus, P. aeruginosa (NCCP 15783), S. lugdunensis, S. epidermidis y E. cloacae cambió a marrón o negro después de 24 h de incubación, mientras que el de S. anginosus, S. mitis, E. faecalis y K. pneumoniae cambiaron a marrón o negro después de 48 h. P. mirabilis y el otro P. aeruginosa (NCCP 16076) no se volvieron marrón medio o negro hasta las 72 h. La P. aeruginosa (NCCP 16076) que no produce biopelículas fue excluida de experimentos posteriores. En cultivo de agar, la mayoría de los microbios de prueba, incluidos S. agalactiae, S. mitis, S. aureus, P. aeruginosa, S. lugdunensis, E. faecalis y E. cloacae, cambiaron a marrón o negro después de 24 h de incubación, mientras que S. .anginosus, S. epidermidis, K. pneumonia o P. mirabilis mostraron colonias de color marrón a negro después de 48 o 72 h. Aunque todas las bacterias analizadas aquí eventualmente produjeron biopelículas, requirieron diferentes tiempos para formar biopelículas (Fig. 1b).

Pruebas de rojo Congo para detectar la producción de biopelículas de microorganismos. (a). Imágenes representativas de pruebas de rojo Congo con cultivo en caldo (izquierda) y placas de agar (derecha) a las 24, 48 y 72 h. (b) Mapa de calor para los resultados de la prueba del rojo Congo de 11 microorganismos utilizados a lo largo de este estudio. Cada número en la barra de escala indica el color del medio de la siguiente manera: 1 = rojo, 2 = rojo oscuro, 3 = marrón, 4 = marrón oscuro, 5 = negro.

Examinamos la curva de crecimiento de cada microorganismo para descartar la posibilidad de que las diferencias en el tiempo necesario para formar biopelículas pudieran atribuirse a diferentes tasas de crecimiento bacteriano (Figura 1 complementaria). El tiempo para alcanzar la fase estacionaria fue de 6 a 12 h, según el microbio de prueba, y el grado de crecimiento máximo osciló entre 0,2 y 0,6 con una DO600 (Tabla complementaria 2). Aunque se demostró que P. mirabilis era el más lento en formar biopelículas en la Fig. 1, el tiempo hasta la fase estacionaria (8 h) y la DO600 en ese momento (0,44) no fueron inferiores a los de otros. En otras palabras, su tasa de crecimiento y cantidad de células no fueron las más bajas entre los microbios de prueba. Por otro lado, S. aureus, el productor de biopelículas más rápido en la Fig. 1, alcanzó la fase de crecimiento estacionario después de 10 a 11 h, que fue relativamente tarde en comparación con otros microorganismos. Además, S. epidermidis, otro productor rápido de biopelículas en la Fig. 1, fue similar en tasa de crecimiento y extensión a P. mirabilis, el productor de biopelículas más lento en la Fig. 1. Por lo tanto, indica que el momento y el grado de formación de biopelículas que se muestra en la Fig. 1 fue el resultado de las capacidades innatas de formación de biopelículas de cada microbio en lugar de diferencias en las tasas de crecimiento o el número de células.

El PS se usa ampliamente en campos médicos para una variedad de aplicaciones médicas, incluidos componentes de diagnóstico, carcasas para kits de prueba y dispositivos médicos, además de usarse como superficie común para pruebas de formación de biopelículas23,26,28. Cultivamos cada microbio en un tubo de cultivo hecho de PS para examinar la formación de su biopelícula en esta superficie. El sobrenadante que contenía células planctónicas no adherentes y cada tubo de cultivo que contenía biopelícula se recogieron por separado después de 24, 48 y 72 h. La densidad óptica (OD) de cada sobrenadante se midió a 600 nm para investigar el crecimiento planctónico de cada microorganismo; cada tubo de cultivo se sometió a un ensayo CV (medido a 550 nm) para cuantificar la producción de biopelículas, cuyos valores se muestran en la Fig. 2a. Además, cada célula planctónica en el sobrenadante se cuantificó mediante un ensayo CV después de separarse mediante centrifugación (Fig. 2b). Los microorganismos probados mostraron diferentes niveles de formación de biopelículas en PS en un cultivo de 24 h. Después de eso, algunos de ellos, incluido S. agalactiae, aumentaron la formación de biopelículas a 48 o 72 h, mientras que otros, incluidos E. faecalis, E. cloacae, K. pneumoniae y P. mirabilis, tendieron a mantener su nivel inicial durante todo el experimento. Los niveles de formación de biopelículas en PS no se correlacionaron con la cantidad o el crecimiento de células planctónicas (Fig. 2b, c). Curiosamente, el nivel de células planctónicas de S. lugdunensis fue relativamente bajo a pesar de sus altos niveles de biopelícula, mientras que E. cloacae, K. pneumoniae y P. mirabilis mostraron niveles relativamente altos de células planctónicas en comparación con la producción de biopelículas. Estos resultados demostraron que el grado de crecimiento de las células planctónicas y la capacidad de formar biopelículas en PS no están directamente relacionados. De hecho, los niveles de producción de biopelículas disminuyeron entre los microbios con altos niveles de crecimiento de células planctónicas (Fig. 2d). Para una comprensión integral e intuitiva, clasificamos arbitrariamente cada microorganismo en grupos fuertes (más de 0,2), intermedios (de 0,05 a 0,2) y débiles (menos de 0,05) por su capacidad de formar una biopelícula en la superficie del PS de acuerdo con el color teñido con CV. valores en el momento de 72 h (Tabla 1).

Formación de biopelículas sobre superficie de poliestireno (PS). Cada microorganismo se cultivó en tubos de PS durante 24, 48 o 72 h. Los tubos de cultivo y sus sobrenadantes se recogieron por separado en cada momento. (a) Los tubos de cultivo con biopelícula se tiñeron con cristal violeta (CV) y se midió su absorbancia a 550 nm para evaluar la formación de biopelícula en la superficie. (b) Los sedimentos de células planctónicas en cada sobrenadante se tiñeron por separado con CV. Se midieron sus absorbancias a 550 nm para evaluar la cantidad de células planctónicas en el tubo. (c) La densidad óptica (OD) de los sobrenadantes que contienen células planctónicas no adherentes se midió a 600 nm. (d) Los valores de DO obtenidos del ensayo de CV para la formación de biopelículas se dividieron por la suma de los valores de DO del ensayo de CV para la formación de biopelículas en la superficie y del sobrenadante que contiene células planctónicas para calcular la proporción de formación de biopelículas.

Luego investigamos las capacidades de formación de biopelículas de los patógenos en titanio (Ti), un biomaterial importante y emergente frecuentemente utilizado en prótesis27. Después de un cultivo bacteriano de 72 h, las placas de Ti se recogieron por separado para realizar un ensayo de CV y ​​se midió la DO de cada sobrenadante de cultivo restante para cuantificar el crecimiento de células planctónicas. De los resultados del experimento PS, la DO del sobrenadante y los resultados del ensayo CV de las células planctónicas en cada sobrenadante fueron proporcionales, por lo que en el experimento Ti, se excluyó el proceso de ensayo CV de las células planctónicas. Al igual que los resultados de PS, cada microorganismo formó una biopelícula en la superficie de Ti en un grado diferente (Fig. 3a). P. aeruginosa y S. lugdunensis produjeron niveles más altos de biopelícula sobre Ti, mientras que S. aureus, S. epidermidis y E. faecalis mostraron capacidades más débiles. Nuevamente, la cantidad de crecimiento de células planctónicas no se correlacionó con el nivel de formación de biopelículas en la mayoría de los microorganismos de prueba (Fig. 3b). En particular, P. aeruginosa formó niveles más altos de biopelícula pero mostró un menor crecimiento de células planctónicas que otros. Al considerar el grado de formación de biopelículas como proporción del total de bacterias, la capacidad de formar biopelículas fue menor para los microbios con altos niveles de crecimiento de células planctónicas (Fig. 3c). Como se hizo anteriormente para los resultados de PS, cada microorganismo se comparó relativamente mediante clasificación en grupos fuertes (más de 0,2), intermedios (de 0,05 a 0,2) y débiles (menos de 0,05) para determinar su capacidad para formar biopelículas en Ti de acuerdo con los valores teñidos con CV. (Tabla 1).

Formación de biopelículas sobre titanio (Ti). Cada microorganismo se cultivó en una placa de Ti durante 72 h. Luego se recogieron por separado los sobrenadantes y las placas de Ti. (a) Las placas de Ti se tiñeron con CV y ​​su absorbancia se cuantificó a 550 nm para detectar la formación de biopelículas en la superficie. (b) La DO de los sobrenadantes que contienen células planctónicas no adherentes se midió a 600 nm. (c) Los valores de DO obtenidos del ensayo de CV para la formación de biopelículas se dividieron por la suma de los valores de DO del ensayo de CV para la formación de biopelículas en la superficie y del sobrenadante que contiene células planctónicas para calcular la proporción de formación de biopelículas.

Comparamos las capacidades de formación de biopelículas de los patógenos en superficies de PS o Ti y encontramos patrones consistentes y falta de ellos dependiendo del microorganismo (Fig. 4). Entre los microbios de prueba, S. lugdunensis formó consistente y fuertemente una biopelícula tanto en PS como en Ti. S. agalactiae, S. anginosus, S. mitis, E. cloacae, K. pneumoniae y P. mirabilis formaron consistentemente niveles intermedios de biopelícula en ambas superficies, mientras que E. faecalis mostró las capacidades más débiles en ambas superficies. La capacidad de formación de biopelículas de los demás microorganismos varió según el tipo de superficie. Por ejemplo, P. aeruginosa formó altos niveles de biopelícula en Ti pero no en PS, y S. aureus mostró un nivel intermedio de formación de biopelícula en PS pero débil en Ti. Se demostró claramente que cada microorganismo regulaba su capacidad inherente de formar biopelículas según una superficie determinada.

Comparación de la capacidad de formación de biopelículas en PS y Ti. El diagrama de Venn compara la capacidad de formación de biopelículas de cada microorganismo sobre PS o Ti según su clasificación en cada superficie.

Se sugirió que la hidrofobicidad de la superficie celular (CSH) determinara la adhesión bacteriana a las superficies29, por lo que comparamos la CSH de cada microbio de prueba con su capacidad de formar biopelículas en las superficies (Fig. 5). Las pruebas BATH mostraron un amplio rango de hidrofobicidad entre los microbios analizados en este estudio. Sin embargo, la CSH no se correlacionó con la capacidad general de formación de biopelículas de los microorganismos; El análisis de correlación entre los valores de CSH y CV para la biopelícula mostró que el valor de Pearson r y P fue -0,1882 y 0,5194 para la superficie de PS, o -0,1693 y 0,6188 para la superficie de Ti (Figura complementaria 2). Microorganismos altamente hidrofóbicos, incluido S. mitis, e hidrofílicos, incluido K. pneumoniae, formaron niveles intermedios de biopelícula en ambas superficies. S. lugdunensis, el productor de biopelículas más potente en ambas superficies de este estudio, también tenía una hidrofobicidad moderada. Este resultado indicó que la CSH no era el principal determinante de la capacidad de formación de biopelículas de los patógenos probados en las dos superficies que se muestran arriba.

Pruebas BATH para hidrofobicidad de la superficie celular. Se realizó la prueba de adhesión bacteriana a hidrocarburos (BATH) para medir la hidrofobicidad de la superficie celular de cada microorganismo (%). Los experimentos se repitieron al menos tres veces para cada microorganismo.

Finalmente, investigamos cómo la presión ambiental puede afectar la capacidad de cada patógeno para formar biopelículas en ambas superficies. Para ello, elegimos el EGCG como inhibidor de la supervivencia porque es un agente antibacteriano bien conocido contra un amplio espectro de microorganismos30,31. Los microorganismos se cultivaron durante 72 h en presencia de EGCG. La Figura 6 muestra las cantidades de formación de biopelículas de cada microorganismo en las superficies tras la estimulación con EGCG. Entre los patógenos probados, ocho microorganismos aumentaron o disminuyeron la producción de biopelículas en PS después de la estimulación. En Ti, EGCG afectó la producción de biopelículas de nueve microorganismos. EGCG cambió constantemente los patrones de formación de biopelículas en las superficies de prueba para la mayoría de los microorganismos. S. aureus, E. cloacae y K. pneumoniae mantuvieron la producción de biopelículas en ambas superficies independientemente de la estimulación con EGCG, mientras que P. aeruginosa produjo biopelículas de manera consistente solo en Ti. Curiosamente, EGCG obstaculizó la formación de biopelículas de S. lugdunensis, el productor de biopelículas más potente entre los microorganismos de prueba, en ambas superficies. En general, los patógenos respondieron al EGCG independientemente del tipo de superficie. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Cambios inducidos por galato de epigalocatequina (EGCG) en la formación de biopelículas en PS y Ti. Cada microorganismo se cultivó para formar biopelículas en la superficie de un tubo de PS o una placa de Ti en ausencia o presencia de EGCG. (a) Las biopelículas en la superficie del tubo de PS se tiñeron con CV y ​​su absorbancia se midió a 550 nm. (b) Las biopelículas en la superficie de la placa de Ti se tiñeron con CV y ​​su absorbancia se midió a 550 nm.

Los microbios sobreviven formando biopelículas que amenazan la salud y el estilo de vida humanos32. La biopelícula se puede formar en cualquier superficie por la que pueda fluir el agua, como desagües y barcos33. Por lo tanto, la investigación sobre la formación y prevención de biopelículas ha atraído especialmente la atención en campos relacionados con los sistemas acuáticos y de agua industriales. Aquí, caracterizamos las capacidades de formación de biopelículas de patógenos potencialmente mortales en superficies comúnmente utilizadas en entornos clínicos, que pueden poner en peligro a los pacientes4,34. Este estudio tiene como objetivo comparar relativamente las capacidades intrínsecas de formación de biopelículas de una amplia gama de patógenos clínicamente relevantes. Un hallazgo interesante fue que S. aureus y P. aeruginosa no fueron los productores de biopelículas más potentes en este estudio a pesar de su prevalencia en situaciones clínicas asociadas a biopelículas35. Mientras tanto, encontramos que entre los microbios probados en este estudio, S. lugdunensis formó un nivel relativamente más alto de biopelícula en las superficies de PS y Ti que otros. Por lo tanto, se necesitan estudios para comprender por qué S. aureus o P. aeruginosa se encuentran con mayor frecuencia como causa importante que S. lugdunensis en enfermedades relacionadas con biopelículas.

Cuando se compararon las capacidades de formación de biopelículas con el crecimiento de células planctónicas en las Figs. 2,3, no encontramos correlación directa entre ellos porque los niveles de células planctónicas no coincidieron con los niveles de formación de biopelículas. Como se reveló en estudios publicados anteriormente por otros, de que el crecimiento de las células planctónicas y la formación de biopelículas involucraban diferentes conjuntos de moléculas36,37, nuestro hallazgo también demostró que la formación de biopelículas es un proceso biológico independiente y distinto del modo de crecimiento de las células planctónicas. Por lo tanto, es un desafío predecir la formación de biopelículas con la propiedad de crecimiento de células planctónicas.

Una única señal ambiental también podría afectar la capacidad de formación de biopelículas de una sola especie. El galato de epigalocatequina (EGCG) es un fitoquímico que se encuentra en el extracto de té verde, que tiene potentes actividades antibacterianas y antibiopelículas contra bacterias gramnegativas y grampositivas38,39. Los efectos antimicrobianos del EGCG en varios microbios incluyen unirse y dañar la membrana celular bacteriana a través de la generación de H2O240, alterar los transportadores de la membrana bacteriana41, inhibir la unión de las células bacterianas a las células huésped39, reducir la producción bacteriana de H2S42 y modular las enzimas bacterianas, incluida la ADN girasa43. EGCG también beneficia la salud humana a través de actividades antiinflamatorias, anticancerígenas y antioxidantes44,45,46. Sin embargo, descubrimos que EGCG puede aumentar la formación de biopelículas de algunos microbios. El hallazgo advierte sobre la necesidad de tener precaución en el uso de incluso un solo producto químico. Por lo tanto, sugerimos una prueba de detección previa para la producción de biopelículas de microbiota cuando se aplica un solo agente a un paciente.

Aunque una sola señal regulaba diferencialmente la formación de biopelículas de cada microorganismo, el patrón cambiante fue consistente para ambas superficies en la mayoría de los microbios de prueba. Esto sugiere que la expresión molecular, más que los materiales de la superficie, gobierna la formación de biopelículas. Esta noción debería probarse más a fondo en otras superficies. Curiosamente, EGCG disminuyó la producción de biopelículas de S. lugdunensis, el productor de biopelículas más potente entre los microorganismos de prueba, en ambas superficies. S. lugdunensis es un estafilococo coagulasa negativo que puede causar infecciones graves, principalmente en pacientes que utilizan prótesis47,48. EGCG también reguló significativamente a la baja la formación de biopelículas de P. aeruginosa, que se encontró que formaba un nivel relativamente más alto de biopelícula en Ti. La aplicación de EGCG es, por tanto, una posible estrategia anti-biopelícula para casos como el revestimiento superficial de implantes protésicos. Por otro lado, como se mencionó anteriormente, la formación de biopelículas de algunos microbios, incluido S. epidermidis, especialmente en Ti, fue regulada positivamente por EGCG. Los resultados obtenidos mediante la estimulación con EGCG presentan una guía útil para la aplicabilidad del producto químico según las circunstancias que involucran la biopelícula de los microbios de prueba.

Se informa que la CSH microbiana es fundamental para la formación de biopelículas29,49,50; sin embargo, la CSH de los diversos microbios utilizados aquí no se correlacionó con sus capacidades de formación de biopelículas. Esto concuerda con otro estudio que encontró sólo un papel menor de la CSH en la formación de biopelículas bacterianas51. Sin embargo, los factores ambientales externos pueden alterar no sólo la producción de biopelículas sino también la CSH, lo que puede conducir a cambios moleculares posteriores que determinan la formación de biopelículas. La interacción de estas variables debería caracterizarse mejor en futuros estudios.

La composición de la comunidad bacteriana probablemente determina la formación de biopelículas a través de una complicada red de señales biológicas. Esto justifica la necesidad de una medicina de precisión, ya que los individuos con diferente microbiota pueden responder de manera diferente a una señal externa. En este sentido, este estudio tiene importancia al proporcionar un catálogo con las capacidades de formación de biopelículas de varios microorganismos en superficies clínicamente relevantes. Nuestro trabajo puede ayudar a muchos estudios futuros que guiarán a los médicos en la prevención de afecciones potencialmente mortales en entornos clínicos. Además, este estudio puede proporcionar aplicaciones prácticas para futuros estudios sobre biopelículas bacterianas. En primer lugar, este estudio sugiere el uso de P. aeruginosa al seleccionar un tema para estudios asociados a biopelículas cercanos a los modelos clínicos. Debido a la incidencia clínica, muchos estudios relacionados con biopelículas han utilizado S. aureus como único sujeto de prueba. Sin embargo, este estudio sugiere que el uso único de S. aureus puede inducir a error en los resultados. Incluso con una simple comparación en nuestros estudios, P. aeruginosa formó una cantidad más considerable de biopelícula en una superficie determinada cuando S. aureus no mostró una formación significativa de biopelícula. Lo más importante es que este estudio mostró claramente que la formación de biopelículas podría ser diferente según el material de la superficie proporcionada. Por lo tanto, aunque el PS se ha utilizado ampliamente como material de superficie para la formación de biopelículas en estudios previos, sugerimos que se seleccione adecuadamente un material de superficie para estudios asociados a biopelículas de acuerdo con los propósitos de interés.

Las especies de microorganismos utilizados en este estudio (Tabla complementaria 1) se seleccionan debido a su frecuencia encontrada en infecciones periprotésicas. Los microbios se obtuvieron de la Colección Nacional de Cultivos de Patógenos (NCCP, Corea). Se utilizó agar de soja tríptico (TSA, Difco) o caldo de soja tríptico (TSB, Difco) para cultivar bacterias a menos que se especifique lo contrario. El cultivo bacteriano primario se preparó inoculando una sola colonia en placas de agar en medio de caldo e incubando durante la noche a 37 °C con agitación a 120 rpm.

El caldo rojo Congo y el ensayo de agar se prepararon como se describe en otros estudios52,53. Brevemente, se preparó medio TSB o TSA con 3,6% adicional de sacarosa (SIGMA S0389) y 0,08% de tinte rojo Congo (SIGMA C6277). Se sembró en estrías un inóculo lleno de asa de la bacteria procedente del cultivo en caldo durante la noche sobre una placa TSA que contenía rojo Congo para la prueba de agar. Se inoculó una colonia de bacterias en una placa TSA en TSB que contenía rojo Congo para la prueba de caldo. Los colores de las colonias o del caldo se observaron después de incubaciones de 24, 48 y 72 h. Los colores de marrón a negro se consideraron positivos para la formación de biopelículas.

Todos los procedimientos o materiales, dispositivos y equipos experimentales se realizaron o mantuvieron asépticamente; Se confirmó la falta de contaminación cruzada utilizando placas vacías. El cultivo primario se diluyó con caldo fresco para lograr una densidad óptica (OD) a 600 nm (OD600) con un valor de 0,9 a 1,0 (espectrofotómetro DeNovix DS-C) para la prueba de formación de biopelículas en PS. Para esta prueba, utilizamos tubos de fondo redondo de 14 ml (40114; SPL Life Sciences, Corea) fabricados de PS, que se utiliza comúnmente en experimentos de formación de biopelículas22,25. Se dispensó una suspensión bacteriana diluida de 1 ml en un tubo de fondo redondo de 14 ml que se esterilizó mediante irradiación gamma, seguido de una incubación a 37 °C con agitación a 50 rpm54 durante 24, 48 y 72 h. Luego se recogieron por separado las células planctónicas no adherentes y los tubos de cultivo.

Se prepararon placas rectangulares de TiAl6V4 (Grado 23: 90% titanio, 60% aluminio, 4% vanadio, 20 ancho × 16 alto mm; Jeil Medical Corporation, Corea) para la prueba de formación de biopelículas en Ti sumergiéndolas en acetona y enjuagando con agua ultrapura. agua, seguido de autoclave a 121 °C durante 20 min con una presión de 15 psi. Después de secar en un horno seco a 60 °C, la placa de Ti rectangular esterilizada en autoclave se colocó en el fondo de un tubo cónico de 50 ml. Después de diluir el cultivo primario 100 veces (OD600 = aproximadamente 0,01) con caldo fresco, se añadió una alícuota de 5 ml de la suspensión bacteriana diluida a los tubos que contenían Ti; la placa de Ti se sumergió hasta la mitad para formar una biopelícula en la interfaz aire-líquido en el medio. Las tapas se cerraron herméticamente durante la incubación a 37 °C con agitación a 50 rpm55 durante tres días. Finalmente, las placas de Ti se recuperaron por separado de las células planctónicas no adherentes y de los tubos de cultivo.

La formación de biopelículas se cuantificó mediante tinción con tinte violeta cristal (CV; SIGMA V5265; Sigma-Aldrich, EE. UU.) como se describió anteriormente56. Después de lavar tres veces con agua ultrapura esterilizada en autoclave, los sedimentos, placas o tubos de células planctónicas se colocaron en una solución CV al 0,1% durante 10 a 15 minutos, seguido de otros tres lavados con agua ultrapura esterilizada en autoclave. Las biopelículas teñidas con CV y ​​los sedimentos de células planctónicas se secaron al aire y luego se disolvieron en una solución de ácido acético al 30% (DUCKSAN 414 grado extra puro, Corea) durante 15 a 20 minutos. Las fracciones solubilizadas se transfirieron por triplicado (100 μl cada una) a placas de 96 pocillos y sus absorbancias (DO550) se evaluaron a 550 nm57,58 utilizando un espectrofotómetro UV-Visible (Lector de placas multimodo TECAN SPARK™ 10 M con SPARKCONTROL). Los datos se analizaron a partir de experimentos repetidos (N = 2 ~ 3), incluidos n = 9 para PS y n = 4 para Ti, respectivamente.

Los microbios se incubaron en 4 ml de TSB durante 24 h a 37 °C y 120 rpm. El cultivo bacteriano de la noche a la mañana se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS; SIGMA D8537) dos veces de la siguiente manera: los microbios se sedimentaron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos y luego se eliminó el sobrenadante antes de resuspenderlo en PBS. Después de medir la absorbancia a 600 nm [A] por triplicado, al cultivo bacteriano se le añadió 1 ml de decano (SIGMA-ALDRICH D901) y se mezcló completamente mediante agitación vortex durante 1 min, seguido de reposo durante 15 min a temperatura ambiente. Se eliminó la fase superior que contenía decano y se midió la absorbancia de la fase clara restante a 600 nm [B] por triplicado. Los resultados se analizaron utilizando la ecuación. (1). Los microbios con una hidrofobicidad inferior al 20%, entre el 20 y el 50% y superior al 50% se definieron como hidrofílicos, moderadamente hidrofóbicos y altamente hidrofóbicos, respectivamente.

Cada microorganismo se dividió según criterios subjetivos en un grupo fuerte, intermedio o débil según los valores obtenidos del ensayo CV para comprender intuitivamente la capacidad de formación de biopelículas de cada microbio mediante comparación relativa. La prueba t no apareada y el ANOVA unidireccional ordinario se realizaron utilizando GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., EE. UU.) para evaluar diferencias significativas entre los grupos. El nivel de significación entre cada grupo fue P <0,0001.

Se disolvió EGCG (SIGMA-ALDRICH PHR1333) en agua destilada esterilizada para obtener una solución madre de 10 mM. Luego, la solución madre se filtró dos veces a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm y se almacenó a 4 °C hasta su uso. Se añadió la cantidad adecuada de solución madre a los medios de cultivo para obtener una concentración final de 1 mM, que se determinó en nuestros experimentos preliminares no publicados.

Se inoculó una colonia de cada microorganismo en la placa madre de agar en medio TSB (5 ml) y se incubó durante la noche a 37 °C. Luego se diluyó el cultivo bacteriano de la noche a la mañana (250 ul) a 1:100 (OD600 = aproximadamente 0,01) en medio TSB nuevo (25 ml) y se midió la densidad óptica (DO) a 600 nm (tiempo 0) usando un espectrofotómetro, seguido mediante incubación a 37 °C. Se tomaron alícuotas (1 ml) de la suspensión del cultivo bacteriano y se controló la tasa de crecimiento a intervalos de una hora midiendo la DO a 600 nm.

Todos los conjuntos de datos generados o analizados durante este estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Esta investigación fue apoyada por la subvención del Fondo de Desarrollo de Dispositivos Médicos de Corea financiada por el gobierno de Corea (el Ministerio de Ciencia y TIC, el Ministerio de Comercio, Industria y Energía, el Ministerio de Salud y Bienestar, el Ministerio de Seguridad de Alimentos y Medicamentos) ( Número de proyecto: KMDF_PR_20200901_0082, 9991006755) y Fondo de Investigación de la Universidad Hallym.

Estos autores contribuyeron igualmente: Jung-Ah Cho y Yoo Jin Roh.

Escuela de Estudios Universitarios, Facultad de Estudios Transdisciplinarios, Instituto de Ciencia y Tecnología Daegu Gyeongbuk, Daegu, 42988, República de Corea

Jung Ah Cho

Departamento de Cirugía Ortopédica, Hospital Sagrado Dongtan, Universidad Hallym, Hwasung, 18450, República de Corea

Jung Ah Cho, Hye Rim Son y Sung Jae Kim

Departamento de Nueva Biología, Instituto Daegu Gyeongbuk de Ciencia y Tecnología, Daegu, 42988, República de Corea

Yoo Jin Roh, Hye Rim Son, Hojung Choi y Chang-Hun Lee

Departamento de Química, Universidad de Hanyang, Seúl, 04762, República de Corea

Hojung Choi

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad Chosun, Gwangju, 61452, República de Corea

Jeong Won Lee

Nuevo Centro de Investigación en Biología, Instituto Daegu Gyeongbuk de Ciencia y Tecnología, Daegu, 42988, República de Corea

Chang Hun Lee

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J.-AC y YJR realizaron la mayoría de los experimentos, analizaron datos y escribieron la primera versión del manuscrito. HRS y HJC realizaron algunos experimentos clave y analizaron datos. J.-WL, SJK y C.-HL iniciaron y supervisaron el proyecto, diseñaron los experimentos y escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jeong-Won Lee, Sung Jae Kim o Chang-Hun Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Cho, JA., Roh, YJ, Son, HR et al. Evaluación de la capacidad de formación de biopelículas en superficies sólidas de patógenos asociados a infecciones periprotésicas. Informe científico 12, 18669 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22929-z

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Recibido: 07 de septiembre de 2022

Aceptado: 20 de octubre de 2022

Publicado: 04 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22929-z

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